38例散发乳腺癌患者BRCA1基因突变检测
作者：赖春宁 江泽飞 宋三泰 王建安 黎燕 沈倍奋
单位：赖春宁 江泽飞 解放军307医院肿瘤三科；宋三泰 王建安 黎燕 沈倍奋军事医学科学院基础医学研究所(北京，100850)
关键词：BRCA1基因；PCR-SSCP；乳腺肿瘤
癌症990409
【摘要】目的：分析38例散发乳腺癌患者BRCA1基因突变情况及突变位置。方法：应用PCR-SSCP(Single-stranded conformational polymorphism, SSCP)和直接测序方法。结果：4/38例患者BRCA1基因有突变，突变例数占总例数的10.5%，其中3例突变位置在内含子的拼接区，一例突变位置在11号外显子上。结论：筛查BRCA1基因突变对于乳腺癌患病风险评估、发病检测、早期诊断及基因治疗具有重要的临床意义。
, 百拇医药
中图分类号：R737.9；R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0389-03
Analysis of the mutations of BRCA1 gene in 38 breast cancer patients
LAI Chun-ning, JIANG Ze-fei,SONG San-tai,et al.
Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,P.R.China
【Abstract】 Objective：To analyse the mutations of BRCA1 gene from 38 breast cancer patients. Methods：SSCP (Single Strand conformational polymorphism,SSCP)and sequencing methods.Results：Four out of thirty-eight(10.5%)cases had mutated,3 cases mutations intron splicing region,one mutation in exon 11.Conclusion：Mutation analysis of BRCA1 may be helpful for determining the developmental potentia, earlier dignosis and gene therapy of breast cancer.
, 百拇医药
Key words：BRCA1 gene;PCR-SSCP;Breast Cancer
肿瘤易感基因BRCA1(breast and ovarian cancer susceptibility gene, BRCA1)是近年来发现的重要的肿瘤抑制基因，研究表明BRCA1基因与乳腺癌、卵巢癌发生有密切联系，它的失活可导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生[1]，BRCA1基因突变者患癌的风险远高于普通群体，对于有家族史的高危人群中筛查BRCA1基因，对于乳腺癌、卵巢癌患病风险评估、发病检测、早期诊断及今后的基因治疗等都有很重要的临床意义。
本研究选取BRCA1基因外显子2，11，20上各一对引物，应用DNA单链构像多态性分析SSCP(Single-stranded conformational polymorphism, SSCP)和直接测序方法检测38例临床上病理确诊为散发的乳腺癌患者BRCA1基因的突变情况。
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1 材料和方法
1.1 材料
患者血液样品来源于307医院肿瘤三科乳腺癌患者，经肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离单个核细胞后记数备用。Taq酶，DNA回收试剂盒为Promega公司产品，310型测序仪为PE公司生产。
1.2 DNA提取方法
取淋巴细胞2×106加入500μl含10%SDS，100mg/ml蛋白酶k的细胞裂解液中，37℃水浴16小时，然后加入等体积的1∶1酚和氯仿混合液，震荡混匀后12000转离心5分钟，取上清加入2.5倍体积乙醇放置20分钟，12000转离心去上清收集沉淀，沉淀用100μl水溶解-20℃保存备用。
1.3 BRCA1基因引物选择
依据文献[2]提示选择BRCA1基因外显子2，11，20各一对引物，本室合成仪合成PAGE纯化定量。
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Exon2：5’GAAGTTGTCATTTTATAAACCTTT3’
5’TGTCTTTTCTTCCCTAGTATG3’
Exon11：5’AAAGCCAGGGAGTTGGTCTGAG3’
5’GTGCTCCCAAAAGCATAAA3’
Exon20：5’ATATGACGTGTCTGCTCCAC3’
5’GGGAATCCAAATTACACAGC3’
1.4 非同位素PCR-SSCP检测方法
PCR-SSCP常规检测方法，取PCP扩增产物5μl加入(含95%甲酰胺，10mmol/LEDTA)变性液，放入90℃水中保温10分钟，立刻放入冰浴中10分钟。将变性后的样品加到6%非变性聚丙酰胺凝胶中，100v电压跑10小时，然后将胶银染观察结果。
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1.5 序列分析
将PCR产物用DNA回收试剂盒回收纯化，定量后应用上述引物，310自动测序仪直接测序。
2 结果
2.1 乳腺癌患者BRCA1基因检测
提取38例临床确诊散发的乳腺癌患者基因组DNA，年龄最小22岁，最大74岁，平均年龄47.8岁，全部为女性患者。应用上述三对引物分别对每个病人基因组DNA进行PCR扩增，并且应用非同位素SSCP方法观察其DNA多态性。结果表明：5，25，36号患者BRCA1基因外显子20上表现有突变的可能性，29号患者在外显子11表现有突变的可能见图1，2，3，4。
图1 36号患者SSCP及序列分析
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A.SSCP1.患者的DNA样品(patientDNA)2,3对照(normal)
B.序列分析(direct sequencing)
图2 5号患者SSCP检测及序列分析
A.SSCP：1为患者的DNA样品(patientDNA)2,3对照(normal)
B.序列分析(direct sequencing)
图3 25号患者SSCP检测及序列分析
A.SSCP5为患者的DNA样品(patientDNA)3,4对照(normal)
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B.序列分析(direct sequencing)
图4 29号患者SSCP检测及序列分析
A.SSCP2为患者的DNA样品(patientDNA)1,3对照(normal)
B.序列分析(directsequencing)
2.2 BRCA1基因序列分析
取上述SSCP方法分析有突变可能的5，25，36，29号病人基因组DNA的PCR产物，用PCR回收试剂盒纯化回收基因片段，经自动测序仪序列分析如下：36，5，25，29号患者BRCA1基因有改变，其中36号患者(66岁)BRCA1基因在71768位置缺失TTT三个碱基；5号患者(23岁)有单碱基改变位置在71709由T-C；25号患者(26岁)突变位置在71603碱基由TG-CC，以上患者突变位置在BRCA1基因内含子拼接区上。29号患者(44岁)突变位置在BRCA1基因11号外显子上，位置4210缺失AACT四个碱基，导致丢失一个脯氨酸(1403)和一个苏氨酸(1404)，并且在1405产生终止码。见表1，图1、2、3、4。
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注：*cDNA
表1 序列分析乳腺癌患者BRCA1基因突变位置 病例号
年龄
性别
引物(号)
突变位置
突变情况
36
66
F
20
71768
TTT
, 百拇医药
5
23
-
20
71709
T-C
25
26
-
20
71603
TA-CC
29
, http://www.100md.com 44
-
11
4210*
AATC
3 讨论
自从1994年由Milk等人，将BRCA1基因克隆定位以来，人们对其进行了较深入的研究。大量的实验结果支持BRCA1基因为抑癌基因，其抑癌作用是隐性存在的，当基因发生突变时所编码的蛋白质表现为功能降低或丧失，它的失活使细胞分化受阻，失去正常分化对增殖的作用，从而导致细胞恶变和肿瘤的发生[3]。由于BRCA1基因的突变可造成乳腺癌和卵巢癌易感性增高，作用遗传性状，以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。BRCA1基因有很高的外显率，BRCA1突变基因携带者至60岁时，乳腺癌累积发病率为54%，卵巢癌累积发病率为30%。BRCA1突变基因携带者乳腺癌和卵巢癌相对危险性40岁以前远远大于一般人群[4]。
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BRCA1基因可发生多形式多位点的基因突变。目前发现突变位点以外显子11(占48.5%)，2(占18.6%)，20(占9.2%)，5(占8.2%)18及21(各占3.1%)为多见[5]。本研究选择文献提示突变率比较高的2，11，20外显子上各一对引物，提取38例散发的乳腺癌患者基因组DNA，应用PCR-SSCP和直接测序方法检测乳腺癌患者BRCA1基因突变及突变位置。测序结果在GeneBank进行比较，结果显示：病例中的4例与野生型BRCA1基因比较发生杂合性突变。4例中有3例突变位置在内含子拼接区，一例病人突变位置在外显子11上，位置在4210缺失AACT四个碱基，导致一个脯氨酸和一个苏氨酸丢失，并且在1405位置产生终止码，从而导致BRCA1基因COOH-末端丢失掉459个氨基酸残基。上述结果表示：4例有BRCA1基因突变患者，有3例突变位置在BRCA1基因的20号外显子引物上；1例在11号外显子引物上，而文献认为的突变率较高2号外显子，38例病人基因组DNA分析并没有在这个位置检测出突变基因，由于检测的病例还比较少，今后需要扩大病例提高检测率，以进一步去证实。
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参考文献
1 Swift M,Morrell D, Massey R B,et al. Indidence of cancer in 161 families affected with ataxia-telangiectasia [J] . N Engl J Med,1991,32：1831～1836.
2 Friedman LS, Ostermeyer EA, Szabo CI, et al.Confirmation of BRCA1 by analysis of gremline mutations linked to breast and ovarian cancer in ten families. Nat Genet,1994,8：399～404.
3 李士谔.细胞分化在致癌和抑癌中的作用[J].中国医学科学院学报，1994，16(1)：73～78.
, 百拇医药
4 Hogervorst FB,Cornelis RS, Bout M, et al. Rapid detection of BRCA1 mutations by the protein truncation test [J] .Nat Genet,1995,10(2)：208～212.
5 Shattuck-Eidens D,McClure M,Simard J,et al. A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene Implications for presymptomatic testing and screening [J] . JAMA.1995,273(7)：535～541.
收稿日期：1999-03-23；修回日期：1999-04-06, http://www.100md.com
单位：赖春宁 江泽飞 解放军307医院肿瘤三科；宋三泰 王建安 黎燕 沈倍奋军事医学科学院基础医学研究所(北京，100850)
关键词：BRCA1基因；PCR-SSCP；乳腺肿瘤
癌症990409
【摘要】目的：分析38例散发乳腺癌患者BRCA1基因突变情况及突变位置。方法：应用PCR-SSCP(Single-stranded conformational polymorphism, SSCP)和直接测序方法。结果：4/38例患者BRCA1基因有突变，突变例数占总例数的10.5%，其中3例突变位置在内含子的拼接区，一例突变位置在11号外显子上。结论：筛查BRCA1基因突变对于乳腺癌患病风险评估、发病检测、早期诊断及基因治疗具有重要的临床意义。
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中图分类号：R737.9；R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0389-03
Analysis of the mutations of BRCA1 gene in 38 breast cancer patients
LAI Chun-ning, JIANG Ze-fei,SONG San-tai,et al.
Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,P.R.China
【Abstract】 Objective：To analyse the mutations of BRCA1 gene from 38 breast cancer patients. Methods：SSCP (Single Strand conformational polymorphism,SSCP)and sequencing methods.Results：Four out of thirty-eight(10.5%)cases had mutated,3 cases mutations intron splicing region,one mutation in exon 11.Conclusion：Mutation analysis of BRCA1 may be helpful for determining the developmental potentia, earlier dignosis and gene therapy of breast cancer.
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Key words：BRCA1 gene;PCR-SSCP;Breast Cancer
肿瘤易感基因BRCA1(breast and ovarian cancer susceptibility gene, BRCA1)是近年来发现的重要的肿瘤抑制基因，研究表明BRCA1基因与乳腺癌、卵巢癌发生有密切联系，它的失活可导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生[1]，BRCA1基因突变者患癌的风险远高于普通群体，对于有家族史的高危人群中筛查BRCA1基因，对于乳腺癌、卵巢癌患病风险评估、发病检测、早期诊断及今后的基因治疗等都有很重要的临床意义。
本研究选取BRCA1基因外显子2，11，20上各一对引物，应用DNA单链构像多态性分析SSCP(Single-stranded conformational polymorphism, SSCP)和直接测序方法检测38例临床上病理确诊为散发的乳腺癌患者BRCA1基因的突变情况。
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1 材料和方法
1.1 材料
患者血液样品来源于307医院肿瘤三科乳腺癌患者，经肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离单个核细胞后记数备用。Taq酶，DNA回收试剂盒为Promega公司产品，310型测序仪为PE公司生产。
1.2 DNA提取方法
取淋巴细胞2×106加入500μl含10%SDS，100mg/ml蛋白酶k的细胞裂解液中，37℃水浴16小时，然后加入等体积的1∶1酚和氯仿混合液，震荡混匀后12000转离心5分钟，取上清加入2.5倍体积乙醇放置20分钟，12000转离心去上清收集沉淀，沉淀用100μl水溶解-20℃保存备用。
1.3 BRCA1基因引物选择
依据文献[2]提示选择BRCA1基因外显子2，11，20各一对引物，本室合成仪合成PAGE纯化定量。
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Exon2：5’GAAGTTGTCATTTTATAAACCTTT3’
5’TGTCTTTTCTTCCCTAGTATG3’
Exon11：5’AAAGCCAGGGAGTTGGTCTGAG3’
5’GTGCTCCCAAAAGCATAAA3’
Exon20：5’ATATGACGTGTCTGCTCCAC3’
5’GGGAATCCAAATTACACAGC3’
1.4 非同位素PCR-SSCP检测方法
PCR-SSCP常规检测方法，取PCP扩增产物5μl加入(含95%甲酰胺，10mmol/LEDTA)变性液，放入90℃水中保温10分钟，立刻放入冰浴中10分钟。将变性后的样品加到6%非变性聚丙酰胺凝胶中，100v电压跑10小时，然后将胶银染观察结果。
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1.5 序列分析
将PCR产物用DNA回收试剂盒回收纯化，定量后应用上述引物，310自动测序仪直接测序。
2 结果
2.1 乳腺癌患者BRCA1基因检测
提取38例临床确诊散发的乳腺癌患者基因组DNA，年龄最小22岁，最大74岁，平均年龄47.8岁，全部为女性患者。应用上述三对引物分别对每个病人基因组DNA进行PCR扩增，并且应用非同位素SSCP方法观察其DNA多态性。结果表明：5，25，36号患者BRCA1基因外显子20上表现有突变的可能性，29号患者在外显子11表现有突变的可能见图1，2，3，4。
图1 36号患者SSCP及序列分析
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A.SSCP1.患者的DNA样品(patientDNA)2,3对照(normal)
B.序列分析(direct sequencing)
图2 5号患者SSCP检测及序列分析
A.SSCP：1为患者的DNA样品(patientDNA)2,3对照(normal)
B.序列分析(direct sequencing)
图3 25号患者SSCP检测及序列分析
A.SSCP5为患者的DNA样品(patientDNA)3,4对照(normal)
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B.序列分析(direct sequencing)
图4 29号患者SSCP检测及序列分析
A.SSCP2为患者的DNA样品(patientDNA)1,3对照(normal)
B.序列分析(directsequencing)
2.2 BRCA1基因序列分析
取上述SSCP方法分析有突变可能的5，25，36，29号病人基因组DNA的PCR产物，用PCR回收试剂盒纯化回收基因片段，经自动测序仪序列分析如下：36，5，25，29号患者BRCA1基因有改变，其中36号患者(66岁)BRCA1基因在71768位置缺失TTT三个碱基；5号患者(23岁)有单碱基改变位置在71709由T-C；25号患者(26岁)突变位置在71603碱基由TG-CC，以上患者突变位置在BRCA1基因内含子拼接区上。29号患者(44岁)突变位置在BRCA1基因11号外显子上，位置4210缺失AACT四个碱基，导致丢失一个脯氨酸(1403)和一个苏氨酸(1404)，并且在1405产生终止码。见表1，图1、2、3、4。
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注：*cDNA
表1 序列分析乳腺癌患者BRCA1基因突变位置 病例号
年龄
性别
引物(号)
突变位置
突变情况
36
66
F
20
71768
TTT
, 百拇医药
5
23
-
20
71709
T-C
25
26
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20
71603
TA-CC
29
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11
4210*
AATC
3 讨论
自从1994年由Milk等人，将BRCA1基因克隆定位以来，人们对其进行了较深入的研究。大量的实验结果支持BRCA1基因为抑癌基因，其抑癌作用是隐性存在的，当基因发生突变时所编码的蛋白质表现为功能降低或丧失，它的失活使细胞分化受阻，失去正常分化对增殖的作用，从而导致细胞恶变和肿瘤的发生[3]。由于BRCA1基因的突变可造成乳腺癌和卵巢癌易感性增高，作用遗传性状，以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。BRCA1基因有很高的外显率，BRCA1突变基因携带者至60岁时，乳腺癌累积发病率为54%，卵巢癌累积发病率为30%。BRCA1突变基因携带者乳腺癌和卵巢癌相对危险性40岁以前远远大于一般人群[4]。
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BRCA1基因可发生多形式多位点的基因突变。目前发现突变位点以外显子11(占48.5%)，2(占18.6%)，20(占9.2%)，5(占8.2%)18及21(各占3.1%)为多见[5]。本研究选择文献提示突变率比较高的2，11，20外显子上各一对引物，提取38例散发的乳腺癌患者基因组DNA，应用PCR-SSCP和直接测序方法检测乳腺癌患者BRCA1基因突变及突变位置。测序结果在GeneBank进行比较，结果显示：病例中的4例与野生型BRCA1基因比较发生杂合性突变。4例中有3例突变位置在内含子拼接区，一例病人突变位置在外显子11上，位置在4210缺失AACT四个碱基，导致一个脯氨酸和一个苏氨酸丢失，并且在1405位置产生终止码，从而导致BRCA1基因COOH-末端丢失掉459个氨基酸残基。上述结果表示：4例有BRCA1基因突变患者，有3例突变位置在BRCA1基因的20号外显子引物上；1例在11号外显子引物上，而文献认为的突变率较高2号外显子，38例病人基因组DNA分析并没有在这个位置检测出突变基因，由于检测的病例还比较少，今后需要扩大病例提高检测率，以进一步去证实。
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参考文献
1 Swift M,Morrell D, Massey R B,et al. Indidence of cancer in 161 families affected with ataxia-telangiectasia [J] . N Engl J Med,1991,32：1831～1836.
2 Friedman LS, Ostermeyer EA, Szabo CI, et al.Confirmation of BRCA1 by analysis of gremline mutations linked to breast and ovarian cancer in ten families. Nat Genet,1994,8：399～404.
3 李士谔.细胞分化在致癌和抑癌中的作用[J].中国医学科学院学报，1994，16(1)：73～78.
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4 Hogervorst FB,Cornelis RS, Bout M, et al. Rapid detection of BRCA1 mutations by the protein truncation test [J] .Nat Genet,1995,10(2)：208～212.
5 Shattuck-Eidens D,McClure M,Simard J,et al. A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene Implications for presymptomatic testing and screening [J] . JAMA.1995,273(7)：535～541.
收稿日期：1999-03-23；修回日期：1999-04-06, http://www.100md.com